Защитники также по возможности перегруппировали свои силы. Генуэзец Мануэль с 200 лучниками и арбалетчиками обороняли районы вокруг Золотых Ворот и Студиона; ученый Теофилус Палеолог командовал южным флангом сил у Пигийских ворот, в то время как Джованни Джустиниани Лонго с 400 итальянцами и большая часть византийских отрядов были ответственны за наиболее угрожающий сектор вокруг ворот Святого Романа. Район Мириандрион перешел братьям Антонио, Паоло и Троило Боккиарди. Джироламо Минотто возглавил оборону в районе Влахернского дворца, в их отряде сражался Теодорус из Каристона, о котором в греческих источниках написано как о «лучшем лучнике всех времен и народов». «Способный инженер» Иоханнес Грант защищал Калигарийские ворота. Архиепископ Леонарда Хиосский и некий Иероним обороняли Ксилопорт. Кардинал Исидор со своими людьми, вероятно, защищал стены у мыса Акрополя (сейчас это мыс Сераля). Лука Нотарас осуществлял оборону района Петрион и ворот Святого Феодосия, в то время как 500 лучников и стрелков из пищалей находились на стенах по берегу Золотого Рога. Габриэле Тревизано командовал 50 солдатами, которые охраняли центральную секцию стен Золотого Рога, в то время как команды критских судов занимали башни вокруг Хорайских ворот, вероятно также под командой Тревизано. Антонио Диедо возглавил команды кораблей в Золотом Роге. Каталонский консул Пере Хулиа защищал район Буколеон и частично стены у Контоскалиона. Принц Охран размещался около гавани Ланга, в то время как люди Джакопо Контарини защищали дамбы и башни гаваней Ланга и Псаматии.
Дмитрий Кантакузин со своим зятем Несефором Палайлогосом и другими заняли позицию в районе церкви Святых Апостолов с подкреплением, в то время как император прошел по своим войскам, чтобы повысить моральный дух. Монахи и духовенство вели постоянные религиозные службы, прошли процессии на улицах Константинополя и вдоль стен. Ссоры и раздоры между католиками и православными были забыты, поскольку они по очереди или плечом к плечу непрерывно вели службу в храме Святой Софии. Все прежние обиды исчезли. Почти все, кто был в городе, за исключением солдат, оставшихся на стенах, собрались на это богослужение-моление о заступничестве. Священники, считавшие смертельным грехом унию с Римом, возносили у алтаря молитвы вместе со своими собратьями – униатами. Кардинал стоял рядом с епископами, никогда ранее его не признававшими; весь народ пришел сюда для исповеди и святого причастия, не разбирая, кто служит – православный священник или католический. Вместе с греками здесь были итальянцы и каталонцы. Это был момент, когда в Константинополе произошло действительно объединение восточной и западной христианских церквей.
Приблизительно за три часа перед рассветом 29 мая дозорные на стенах увидели огненные вспышки на позициях оттоманской артиллерии. Оттоманские иррегулярные войска пошли на штурм, ведомые, согласно Александру Ипсиланти, Мустафа-пашой. Главные события происходили вокруг разбитых ворот Святого Романа, где Джустиниани Лонго принял под свое командование отряд из 3 000 человек на внешней стене. Несмотря на ужасные потери, оттоманские добровольцы и башибузуки упорно лезли на стены, пока через два часа боя султан Мехмед не приказал им отступить. Оттоманские корабли в это время подходили к стенам и пытались устанавливать лестницы на самом длинном участке обороны по побережью Мраморного моря, это был отвлекающий маневр, но и в нем турки не преуспели; люди кардинала Исидора и принца Орхана отбили эти атаки, не задействовав основные резервы.
После повторного артиллерийского обстрела в бой были брошены провинциальные отряды. В районе ворот Святого Романа атаку вели анатолийские отряды, экипированные в высококачественную броню. Они широким фронтом с факелами двинулись к стенам в предрассветных сумерках, на вынуждены были сломать строй и надолго застрять у стен, поскольку пробитые пушками бреши были очень узки. Более дисциплинированные, чем башибузуки, они иногда организованно отходили назад, чтобы позволить своей артиллерии сделать несколько залпов, и тут же повторяли приступ. Во время одной из таких бомбардировок секция защитного частокола была сбита. Три сотни анатолийских пехотинцев, ринувшихся в эту брешь, были отброшены. На соседнем участке особенно интенсивной была борьба на влахернских стенах. Александр Ипсиланти с красочными деталями описывает, как анатолийский бейлербей послал пять своих самых сильных солдат в образовавшуюся брешь, где они были встречены протостратором Джустиниани Лонго и его «сыновьями или тремя братьями» (вероятно, речь идет о братьях Боккиарди). К этому времени турецкое наступление выдохлось, и за час до рассвета анатолийским отрядам было приказано отходить.
