В 1453 г. пал Константинополь. Родос остался последним оплотом христианства на востоке. Османский султан Мохаммед II потребовал с ордена дань, но получил отказ. В 1480 г. султан прибыл к берегам острова во главе огромного флота. Осада Родоса продолжалась три месяца, во время осады османы предприняли три попытки решительного штурма. Все они были отбиты, а когда орден получил подкрепления, османам пришлось отступить.
Последняя попытка штурма Родоса состоялась в 1522 г. Ее провел султан Сулейман. Великий магистр Вильер де л’Исль Адам имел в распоряжении 600 госпитальеров и около 4500 местных ополченцев, тогда как турецкая армия насчитывала порядка 100000 человек. Однако Родос был одной из мощнейших крепостей мира, оснащенной превосходной артиллерией. Сулейману потребовалось два месяца, чтобы брешировать стену. На этом участке оборонялись отряды ланжисов Арагона и Англии. На протяжении следующих трех недель османы штурмовали брешь. Три попытки штурма госпитальеры отразили, хотя и сами понесли при этом ощутимые потери. Сулейман отказался от попыток взять крепость штурмом, и приступил к тотальной блокаде. К 20 декабря 1522 г. перед госпитальерами встала угроза голодной смерти. Сулейман не стал упорствовать и согласился на почетные условия капитуляции. Так, орден снова стал бездомным.
Император Карл V предложил ордену перебраться на Мальту с условием участвовать в обороне Триполи на североафриканском побережье. Задача для ордена была очень тяжелой, но в 1551 г. турки овладели Триполи, несмотря на отчаянное сопротивление городского гарнизона. Тем временем орден укрепил Мальту, ведя при этом постоянную войну с североафриканскими пиратами. Пираты серьезно подрывали торговлю на Средиземном море и даже совершали набеги на побережье Италии и Испании. Но закаленный в боях орден повел с пиратами решительную борьбу. Вскоре имена капитанов-госпитальеров стали наводить страх на пиратов.
В 1565 . Сулейман подвел к берегам Мальты флот численностью 180 кораблей, на борту которых находилось около 30000 солдат. Началась осада Мальты. Гарнизон острова усилили за счет рыцарей из всех командерий. Это была последняя и самая знаменитая осада в истории ордена. Гарнизон острова насчитывал 500 рыцарей, 4000 мальтийских ополченцев и около 4500 других солдат, в том числе наемников. Еще 80 рыцарей и 600 солдат сумели прорвать блокаду и присоединиться к гарнизону позднее, но к тому времени Сулейман удвоил численность своей группировки.
Первую атаку принял на себя форт Сен-Эльмо, прикрывавший вход в Большую Гавань. Форт держался месяц, но все же пал. Все защитники форта погибли, турки убили всех, попавших в плен, и выбросили изуродованные тела в гавань. Госпитальеры в ответ казнили турецких пленных, забросив отрубленные головы в лагерь Сулеймана. Таким образом, обе стороны зашли за последнюю черту.
15 июля 1565 года турки начали штурм укреплений с суши и моря. 7 августа им удалось брешировать стену. Мусульмане находились в одном шаге от победы. 19 и 23 августа турки дважды штурмовали брешь, но госпитальеры всякий раз успевали заделать повреждения и отразить атаки противника. Турки потеряли надежду на победу, сняли осаду, погрузились на корабли и уплыли, оставив на острове 24000 погибших. Госпитальеры потеряли 240 рыцарей и около 6000 других солдат.
В 1571 г. турки потерпели поражение в морском сражении при Лепанто. Османская империя больше не получала правителей масштаба Сулеймана, поэтому начала приходить в упадок.
Военная роль Мальты стала уменьшаться, на первый план вышли торговые интересы, крепость постепенно превращалась в дворец. В XVII веке началась вражда между испанским и французским ланжисами, а французская революция 1792 года привела к национализации всех владений ордена во Франции. Потеряв источники дохода, орден пришел в упадок и в 1798 г. капитулировал перед Наполеоном. Будущему императору Франции хватило двух дней, чтобы сломить сопротивление ордена.
